服務介紹
DNA pull down是用於分析蛋白質與DNA互作的一種分析技術。一般來說，該實驗首先需要針對待研究目的基因的調控區域設計並製備特異性探針（以脫硫生物素標記為主流）；同時，製備細胞核提取物；將探針和核提取物共同孵育，DNA結合蛋白就會和靶向序列特異性結合；然後，通過親和素磁珠純化蛋白質DNA複合物；最後針對獲得的蛋白，使用WB驗證或者質譜方式鑒定蛋白質類型。
服務優勢
- 高特異性：能夠高度特異地富集與目標DNA序列相互作用的蛋白質，具有較低的背景幹擾
- 可定量分析：可對DNA-蛋白質相互作用進行定量分析，如熒光或放射性標記的探針，可測量結合的強度和親和力
- 適用於高通量分析：DNA pull-down技術可進行高通量分析，同時研究多個DNA-蛋白質相互作用，提供更全麵的信息和更深入的洞察
- 低樣本量要求：僅需要少量的樣本即可進行實驗，對於限量樣本或珍貴樣本的研究具有重要意義
- 適用範圍廣泛：可在不同實驗條件下應用，包括體外和體內研究，適用於各種生物體係和細胞類型。它可以用於研究不同生物過程中的DNA-蛋白質相互作用，例如基因調控、DNA修複、染色質結構和功能等。無論是研究基礎生物學還是疾病機製，DNA pull-down技術都具有廣泛的適用性
服務流程
客戶提供
DNA序列相關信息或DNA過表達質粒
細胞樣品
如WB檢測則需提供特定蛋白一抗
送樣要求：
1、質粒至少提供10ug
2、凍存細胞兩隻或複蘇細胞兩瓶
3、動物或植物組織至少500mg
4、細胞沉澱至少2*10的7次方
注：除了複蘇細胞常溫運輸以外，其他樣品均幹冰運輸。
最終交付
- 構建含目的基因的質粒、菌液，測序報告
- DNA Pull-down蛋白SDS-PAGE銀染圖
- WB檢測報告/質譜鑒定分析報告
服務說明
| 服務名稱 | 服務內容 | 交付內容及標準 | 服務周期(工作日) |
| DNA pull-down | 探針擴增回收 | 擴增2次 | 16 |
| 蛋白提取+考染 | 1個樣本 | ||
| pull down實驗 | 富集2次：IgG、IP各1次 | ||
| SDS-PAGE銀染 | 跑膠3個泳道：IgG、IP、input | 4 | |
| 質譜鑒定互作蛋白 | 質譜鑒定：IgG、IP | 10-15 |
案例展示
常見問題與解析 (Q&A)
EMSA是用特定序列的標記探針，同待驗證蛋白孵育後進行native-PAGE凝膠電泳，如果存在同探針結合的蛋白，則會出現電泳遷移率明顯低於自由探針的條帶出現。 DNA pull-down是將探針結合在凝膠/磁珠上，以此收集同該DNA探針發生互作的蛋白。ChIP實驗中所檢測的DNA-蛋白互作則發生在活組織細胞內。
相關資源
1、DNA pull-down技術的實驗步驟
● DNA探針的製備：首先，需要合成或製備與目標DNA序列相互作用的探針。探針可以是特定序列的寡核苷酸或DNA片段，可以通過化學合成或PCR擴增等方法獲得。
● DNA探針的修飾：為了方便實驗操作和檢測，DNA探針可以進行修飾，如在末端引入標記物（如生物素或熒光染料）。
● 蛋白質提取：提取目標蛋白質樣品，可以是細胞裂解物、組織提取物或純化的蛋白質。
● DNA探針的固定：將修飾的DNA探針固定在固相載體上，常用的載體有瓊脂糖珠或磁珠。DNA探針與載體的結合可以通過生物素-親和素、亞硫酸酯化學反應等方法實現。
● DNA-蛋白質結合：將蛋白質樣品與固定的DNA探針一起孵育，使其發生特異性結合。在孵育過程中，可以添加適當的緩衝液和輔助物質來維持適宜的條件。
● 洗滌步驟：通過多次洗滌的步驟，去除非特異性結合的蛋白質，以增加實驗的特異性和準確性。洗滌條件可以根據實驗需求進行優化。
● 蛋白質的檢測和分析：通過各種方法，如Western blot、質譜分析、熒光檢測等，對結合到DNA探針的蛋白質進行檢測和分析。可以使用特異性的抗體來檢測目標蛋白質的存在和結合情況。
● 結果解讀：根據實驗結果，解讀蛋白質與DNA之間的相互作用情況，並進一步分析其功能和調控機製。
2、DNA pull-down技術的應用
● 基因調控研究：DNA pull-down技術可用於研究轉錄因子與基因啟動子的結合，揭示基因調控機製和轉錄調控網絡。這對於理解基因表達調控、發育過程和疾病發展等具有重要意義。
● 信號傳導途徑研究：DNA pull-down技術可以用於研究信號傳導途徑中的關鍵蛋白質與DNA的相互作用，如激活因子、抑製因子等，有助於闡明信號傳導機製和調控網絡。
● 疾病機製研究：DNA pull-down技術可用於研究與疾病相關的基因突變位點或調控元件的結合蛋白，幫助揭示疾病的發生和發展機製，為疾病的診斷和治療提供理論依據。
● 藥物開發與篩選：DNA pull-down技術可以用於篩選與特定DNA序列結合的小分子化合物或藥物，幫助尋找新的藥物靶點和開發潛在的藥物治療方法。
● 比較基因組學研究：DNA pull-down技術可用於比較不同物種、不同組織或不同條件下的DNA-蛋白質相互作用，幫助理解基因組的進化、組織特異性和環境適應等方麵的變化。
3、DNA pull-down實驗結果不如預期如何優化
● 問題1：非特異性結合：蛋白質可能與非特定的DNA序列結合，導致背景信號增加。
優化建議：嚐試優化DNA探針的設計，選擇更特異的DNA序列作為探針，以增加結合的特異性。還可以通過引入競爭性DNA或非特異性DNA序列來減少非特異性結合。
● 問題2：低信號強度：信號強度較弱，難以檢測目標蛋白質的結合。
優化建議：優化孵育條件，包括孵育時間、溫度和緩衝液的組成。調整孵育時間可能需要更長的孵育時間，以增加結合的效率。調整溫度可以根據蛋白質的最佳結合溫度進行優化。此外，優化緩衝液的組成，如添加劑或酶抑製劑，可以提高信號強度。
● 問題3：濃度依賴性：蛋白質的結合可能與其濃度相關，導致信號的變化不確定。
優化建議：嚐試不同濃度的蛋白質進行實驗，確定最佳的濃度範圍，以獲得最強的信號。此外，可以使用標準品或內部對照來定量分析，以校正信號的變化。
● 問題4：樣本純度不高：樣本中可能存在雜質或其他幹擾物質，影響目標蛋白質的結合。
優化建議：優化樣品處理步驟，如使用高純度的核酸提取方法，減少雜質的存在。此外，可以使用特異性抗體進行預處理，以去除非特定結合的蛋白質。
