分子互作研究

1.從文庫構建來說： （1） 文庫構建方式靈活：根據樣本的類型，提供的樣本量等方麵考慮，可采用smart，geteway，infusion體外重組和T4體外連接等方式進行文庫構建； （2） 文庫片段大小可控：根據客戶想要研究的蛋白類型大小控製片段的大小，以提高篩選到目標蛋白的可能性。如白細胞介素，生長因子類的小分子蛋白；轉錄因子，信號通路類的分子量稍大一些的蛋白； （3） 單雙雜文庫通用：構建一種類型的文庫，可同時用於單雙雜篩選； 2.對於文庫篩選來說： （1）篩庫方式多樣：可采用mating或共轉的方式進行文庫篩選； （2）互作強弱可控化：提高（降低）篩選壓力，用於篩選出強（弱）相互作用的蛋白。 （3）陽性結果進一步驗證：文庫篩選出的陽性結果，可進行點對點驗證進一步排除假陽性。

主要業務範圍如下： 1.核酵母單/雙雜文庫構建； 2.膜酵母雙雜交文庫構建； 3.核酵母單/雙雜文庫篩選； 4.膜酵母雙雜交文庫； 5.核酵母單/雙雜點對點驗證； 6.膜酵母雙雜交點對點驗證。

（1）HIS3。Y2HGold不能合成組氨酸，因此不能在缺乏這種必需氨基酸的培養基上生長。當誘餌和獵物蛋白質相互作用時，Gal4-responsive His3的表達允許細胞生物合成組氨酸並在其最小的培養基上生長.可添加3’AT進行背景抑製。 （2）ADE2。Y2HGold也不能在不含腺嘌呤的最小培養基上生長。然而，當兩種蛋白質相互作用時，Ade2表達被激活，使這些細胞在Ade最小培養基上生長。 （3）MEL1。MEL-1編碼-半乳糖苷酶，一種在許多酵母菌中自然存在的酶。由於雙雜交相互作用，α-galactosidase (MEL1)由酵母細胞表達和分泌。表達Mel1的酵母菌落在致變色底物X-α-Gal存在下變成藍色。 （4）AUR1-C，AUR1基因的一個顯性突變版本，編碼肌醇磷酸化神經酰胺syn- thase酶。AUR1-C在Y2HGold酵母株中表達，是由於蛋白質與蛋白質的相互作用，使GAL4轉錄激活和DNA結合域接近。可以添加ABA進行背景抑製。, PABAI載體攜帶Ura3基因，PGADT7載體攜帶Leu基因，PGBKT7載體攜帶trp基因, 篩選所用到的平板：一缺：SD/- Ura， SD/- Leu /+AbA ； 二缺：DDO[SD/-Leu/-Trp]， DDO/X[SD/-Leu/-Trp/X-α-gal] ； 三缺：TDO [SD/-Leu/-Trp/HIS3]； 四缺：QDO[SD/-Leu/-Trp/-HIS3/-ADE2]

（1）PGBKT7載體用於構建核酵母雙雜Bait-PGBKT7質粒或作空白對照。 （2）PGADT7載體用於構建核酵母雙雜，單雜Prey-PGADT7質粒或作空白對照。 （3）PABAI 載體用於構建單雜Bait-PABAI質粒。 （4）PGBKT7-53質粒與PGADT7-T質粒作為核酵母雙雜驗證和篩選的陽性對照組。 （5）PGBKT7-lam質粒與PGADT7-T質粒作為核酵母雙雜驗證和篩選的陰性對照組 （6）pOST1-NubI 質粒與pBT3-N-bait質粒作為膜酵母雙雜交驗證和篩選的功能驗證對照組； （7）pBT3-N載體用於構建N端位於胞質，C端位於細胞器腔內（或者胞外）誘餌蛋白； （8）pBT3-SUC載體用於構建N端位於細胞器腔內（或者胞外），且N端含有信號肽的誘餌蛋白； （9）pBT3-STE載體用於構建C端位於胞質，N端位於細胞器腔內（或者胞外），且N端不含信號肽的誘餌蛋白； （10）pBT3-N和pBT3-STE皆可N端C端均位於胞質的誘餌蛋白； （11）pPR3-C載體用於C端位於胞質，N端位於胞外或細胞器腔的獵物蛋白構建； （12）PPR3-N載體用於膜文庫構建和不跨膜的獵物蛋白構建； （13）Ptsu2-APP質粒和pNubG-Fe65質粒作為膜酵母雙雜驗證和篩選的陽性對照組； （14）Ptsu2-APP質粒和PPR3-N質粒作為膜酵母雙雜驗證和篩選的陰性對照組 （15）Y187菌株：Clontech公司開發的GAL4係統酵母單雜，雙雜實驗用菌株，MATα型，可直接轉化質粒或與MATa型酵母菌株（Y2HGold，AH109等）通過mating操作進行篩庫試驗。缺陷 trp1, leu2，報告基因為：lacZ, MEL1。 （16）Y1HGOLD菌株：Clontech公司開發的GAL4-AbA酵母單雜係統用菌株，MATα型，可直接轉化質粒進行篩庫試驗。缺陷 ura3，leu2；報告基因為：AbAr。 （17）Y2HGold菌株：Clontech公司開發的GAL4係統酵母雙雜實驗用菌株，MATa型，可直接轉化質粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation  marker為: trp1, leu2，報告基因為：AbAr, HIS3, ADE2, MEL1。 （18）NMY51菌株:DUALsystems BioTech公司開發的檢測膜蛋白間相互作用的酵母雙雜實驗用菌株，可直接轉化質粒進行蛋白互作驗證或篩庫試驗；此菌株缺陷 trp1, leu2-3，報告基因為：HIS3, ADE2 和 lacZ

建庫：總RNA提取——mRNA分離及純化——雙鏈cDNA合成及純化——雙鏈cDNA與PGADT7載體體外連接——大腸文庫菌液——文庫質粒——轉化Y187酵母宿主——Y187酵母文庫菌液 雙雜篩選：（1）matting方式：誘餌重組質粒PGBKT7載體構建——誘餌重組質粒和PGADT7空載轉Y2Hgold酵母宿主進行自激活驗證——含誘餌的Y2Hgold酵母菌液與Y187酵母文庫菌液進行混合——根據自激活結果塗布篩選平板——陽性結果點鍾——陽性菌培養提質粒——PCR陽性鑒定——送測——測序結果分析 （2）共轉：誘餌重組質粒PGBKT7載體構建——誘餌重組質粒和PGADT7空載轉Y2Hgold酵母宿主進行自激活驗證——文庫質粒轉化含誘餌的Y2Hgold酵母感受態——根據自激活結果塗布篩選平板——陽性結果點鍾——陽性菌培養提質粒——PCR陽性鑒定——送測——測序結果分析 單雜篩選：誘餌重組質粒PABAI載體構建——線性化誘餌重組質粒和PGADT7空載轉化Y1Hgold酵母宿主進行自激活驗證——文庫質粒轉化含誘餌的Y1Hgold酵母感受態——根據自激活結果塗布篩選平板——陽性結果點鍾——陽性菌培養提質粒——PCR陽性鑒定——送測——測序結果分析

可以通過啟動子序列分析查找，確定探針設計範圍，如果範圍太寬泛，可以先將0.5-1kb片段克隆到熒光素酶報告載體驗證其啟動子活性以及是否受到該轉錄因子調控；尋找核心啟動子可以通過分段截斷驗證。如果研究的轉錄因子具有已知的結合序列motif，則可以在該motif位點選擇探針。也可以先進行ChIP或DNA pull down找到富集序列之後，再設計分段探針進行驗證。

a.啟動子結構分析，將啟動子區域序列（通常2k左右）進行分段截短，或對特定位點進行突變，再分別構建入luciferase報告載體，檢測其啟動子活性。 b.啟動子SNP分析，一些基因的啟動子區域存在單核苷酸多態性，可運用熒光素酶報告係統分析其相對活性。 c.驗證特定轉錄因子同其調控序列的作用，將該序列（通常為啟動子區域）插入報告基因載體，同時在實驗細胞中共轉過表達該轉錄因子，可分析轉錄因子過表達是否提高熒光素酶活性。 d.可以分析信號通路是否激活，將該信號通路的下遊響應原件序列構建入報告基因載體，在不同上遊信號條件下，熒光素酶活性代表了通路的下遊響應。例如在GPCR研究中，將cAMP response element（CRE）載入報告基因載體，構建穩定表達細胞株後，可以用於分析GPRC的激活與抑製劑篩選。又如，將HIF1α的響應原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase報告載體構建穩轉細胞株，可以用於低氧相關通路的研究。 e.驗證microRNA的靶序列，將待測的3’UTR序列插入報告基因載體，再共轉入該microRNA，如果熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。

Luciferase的靈敏度相比於GFP提高10-100倍以上，同時具有更寬的動態範圍，便於數值分析比較，不需要熒光顯微鏡，而且在活體實驗中其熒光穿透性高於EGFP等熒光蛋白，同時由於沒有內源活性、其本底信號很低。 而GFP等熒光蛋白相比於熒光素酶的優勢在於可以進行失蹤定位，並且其觀測不需裂解細胞，方便進行適時觀察。

海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶相比，相對活性如何？ 在氧、鎂和ATP的存在下，螢火蟲熒光素酶作用於螢火蟲熒光素，而來源於海洋腔腸（Renilla reniformis)的熒光素酶在氧的存在下作用於海腎熒光素。雙報告基因技術（Dual-reporter assays）,結合了螢火蟲熒光素酶測試和海腎熒光素酶測試。

轉染效率低的話可以從三個方麵改善，首先要確保細胞狀態是好的，通常我們選出處於分裂期的細胞，另外陽性對照您可以選擇過表達的熒光蛋白質粒，還有就是DNA的質量尤為重要，最好是先酶切驗證。 這個實驗檢測結果很靈敏，有一定差異是正常的，通常隻要確保它在一個數量級之內即可。如果差異超出這個範圍可以從兩方麵改善，一是記住保持樣本的均一性，二是加樣要準確。

凝膠遷移或電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一種檢測蛋白質和DNA序列相互結合的技術，可用於定性和定量分析；目前已用於研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，是轉錄因子研究的經典方法。 金開瑞提供EMSA檢測技術服務，幫助您檢測DNA結合蛋白、RNA結合蛋白、特定的蛋白質，並可進行未知蛋白的鑒定。

當客戶用組織或細胞核蛋白進行實驗時，無法確定與探針結合的具體蛋白，需要再提供要研究的抗體，再進行supershift實驗。如果抗體能識別與探針結合的蛋白，則會出現一條超遷移條帶，即可證明探針與蛋白的結合。需客戶提供IP級別的抗體。

使用天然組織細胞樣本進行實驗，通過抽提核蛋白獲取目的蛋白，此為混合蛋白，如要確定某個蛋白結合於探針時，需要加入抗體觀察是否形成超遷移條帶。可以通過重組蛋白表達係統（如金開瑞的大腸、酵母、哺乳、無細胞等）獲得特定的重組蛋白，後續實驗中如出現遷移條帶，則應源於該蛋白的結合作用。

除了探針序列具有理論預測性、本身屬於探索性實驗的情況之外，組織細胞中該轉錄因子豐度較低、隻在特定條件階段表達，特定蛋白同DNA結合需要一定的離子或輔助因子條件（如Mg2+、Zn2+、ATP），重組表達蛋白在DNA結合活性方麵同天然蛋白存在差異，結合力較弱，需要其他蛋白間接作用於DNA等情況下，都難以獲得遷移條帶。此外，當研究的蛋白本身pI較大（如大於8.0），蛋白在native電泳中將難以隨同DNA一起向陽極泳動，或在電泳最初階段同DNA解離開。

免疫沉澱（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原抗體特異性反應純化富集樣品中目的蛋白的一種方法。通常使目標蛋白同抗體-protein A/G形成免疫複合物沉澱而得以收集，然後通過WB檢測目的蛋白。 免疫共沉澱（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是將樣品中同抗體靶蛋白相互作用的蛋白一同隨免疫複合物沉澱，可以檢測兩種目標蛋白質是否在體內存在相互作用，也可以確定一種蛋白在體內的相互作用蛋白。

coIP實驗需要保證足夠的蛋白濃度才能維持原本存在的蛋白互作狀態，尤其當蛋白豐度較低、相互作用力不強、使用不易提蛋白組織等情況時。而且coIP的實驗條件往往需要反複摸索。因此用於coIP實驗需準備細胞＞2x107，動物組織＞500mg，植物組織＞2g，並且須更加注意采集後速凍-80℃保存和避免反複凍融。

a.所使用的抗體不僅需要優秀的親和力、特異性，其識別表位還可能被互作蛋白所掩蔽（主要是使用單抗時）； b.當蛋白互作須發生在特定生理代謝條件、組織細胞類型之中時，coIP實驗可能無法獲得互作結果； c.如果誘餌蛋白和或捕獲蛋白在樣本中豐度很低時； d.兩個互作蛋白的親和力較弱； e.當該蛋白互作需要較特定的離子強度，或者需要如Ca離子/Mg離子/ATP等輔因子時，要創造合適的反應條件會變得困難； f.一些樣品處理提取存在難度，提取足量目的蛋白與保持蛋白天然狀態，需通過實驗條件達到優化平衡； g.外源表達的標簽蛋白存在同內源蛋白的位點競爭，這主要在使用標簽抗體進行實驗時可能存在。

在coIP-WB鑒定結果中，IgG組無目的蛋白條帶、IP組有目的蛋白條帶，說明IP過程成功；銀染膠圖中，IP組相對於IgG組有更多蛋白條帶、且存在差異，說明coIP過程捕獲到互作蛋白；IP產物在質譜檢測中鑒定到的蛋白數量不能作為判斷實驗成敗的標準，因為這取決於目的蛋白本身所具有的互作蛋白數量、結合力強弱等方麵；IP產物的質譜鑒定數量越多並不代表結果越好。

coIP所獲取的樣品，可以借助特異性抗體進行WB驗證某種特定蛋白的存在（即認為互作蛋白），也可進行蛋白質譜鑒定找出互作蛋白，尤其當尋找未知互作蛋白時更需通過質譜分析。 直接用細胞組織內源蛋白進行實驗發現的互作蛋白可能是通過其他蛋白形成複合物，當pull-down體係中僅有兩個重組蛋白、仍然能存在互作時，說明這兩個蛋白是直接互作而不是通過其他蛋白形成多聚複合物。 將蛋白進行分段階段表達之後進行pull-down，可以分析發生互作的結構域；將蛋白進行突變後表達，可以分析互作發生的關鍵氨基酸位點。