服務介紹
實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)/qRT-PCR，是指在PCR反應體係中加入熒光標記物，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過擴增曲線對未知模板進行定量分析的方法。一般用於mRNA轉錄水平的定量研究、不同樣本或基因組中DNA拷貝數的測定、基因芯片結果驗證、藥效分析等。
服務優勢
- 高靈敏度和高特異性：通過熒光信號的實時監測，可以精確定量目標DNA序列的豐度，具有高靈敏度和高特異性。
- 快速和高通量：qRT-PCR反應時間相對較短，可以在較短時間內完成大量樣品的分析，適用於高通量實驗。
- 定量範圍廣：qRT-PCR可以在非常低的目標DNA濃度範圍和非常高的目標DNA濃度範圍內進行定量，具有廣泛的定量範圍。
- 可靠性和準確性：通過內部標準和質量控製，可以減少樣品間和批次間的變異性，提高結果的可靠性和準確性。
- 多功能性：qRT-PCR可以應用於基因表達分析、病原體檢測、突變分析、miRNA研究等多個研究領域，具有廣泛的應用潛力。
服務流程
客戶提供
樣品及盡可能詳細的背景信息（如物種信息，擴增目的基因NCBI登錄號，相關文獻和樣品來源等）。
樣品：組織應不少於100 mg；
細胞10^6-10^7個細胞；
細胞或組織裂解液總RNA濃度須大於1 mg/mL，單個樣品不少於50 μL；
cDNA不少於30 μg。
（組織需液氮速凍、細胞收獲後加入Trizol保存於-80度。樣品用幹冰寄送。避免各類汙染和反複凍融。）
最終交付
- 溶解曲線、Ct值及完整實驗報告；
- 實驗報告內容包括所提取RNA濃度、熒光定量PCR原始數據及分析結果；
- 熒光定量PCR完整的實驗步驟、使用儀器、軟件設置參數等。
服務說明
| 服務名稱 | 服務內容 | 服務周期(工作日) |
|
熒光定量PCR (Real-time qPCR) |
普通引物合成(客戶提供特異性序列) | / |
| 普通引物設計+合成+特異性篩選 | 3-5個 | |
| LncRNA、circRNA設計+合成+特異性篩選 | 6-8個 | |
| MicroRNA引物(客戶提供頸環和qPCR特異性序列) | 12-16個 | |
| MicroRNA頸環引物設計+合成+特異性篩選 | 12-16個 | |
| RNA提取及逆轉錄 | 2-3個 | |
| 熒光定量PCR(不限RNA種類) | 實際樣品數量來定 |
相關資源
1、熒光定量PCR（qRT-PCR）的實驗步驟
● RNA提取：從樣品中提取RNA，確保RNA的質量和純度。常用的RNA提取方法包括酚/氯仿法、矽膠膜柱法等。
● cDNA合成：使用逆轉錄酶（reverse transcriptase）將RNA轉錄成cDNA。反轉錄反應中需要引物（primers）、逆轉錄酶和逆轉錄緩衝液。反轉錄酶會合成相應的cDNA，該cDNA包含了RNA樣品中的目標序列。
● qPCR反應設置：將反轉錄產生的cDNA與引物和熒光探針（如TaqMan探針、SYBR Green探針）一同加入PCR反應混合物中。引物是專門設計的DNA片段，用於特異性擴增目標序列。熒光探針可以結合到擴增產物上，發出熒光信號。
● PCR擴增：通過多個循環的溫度變化，即PCR擴增過程，使目標序列在DNA模板中進行擴增。PCR反應的循環包括變性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）階段。
● 熒光檢測：在PCR反應的延伸階段，熒光探針會與目標序列結合，發出熒光信號。這些信號可以通過熒光檢測儀器實時監測。
● 數據分析：通過熒光信號的強度和PCR循環數，可以計算出目標序列的初始量或相對豐度。數據分析方法包括閾值循環數（Ct）法、標準曲線法等。
2、qRT-PCR實驗結果不如預期可能的原因以及相應的解決方案
| 實驗結果不如預期 |
可能的原因 |
解決方案 |
| 低信號強度或不可檢測的信號 |
樣品中的目標RNA濃度過低 |
檢查RNA提取方法和效果，重新提取樣品或調整稀釋倍數 |
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引物或探針的設計問題 |
重新設計引物或探針，確保與目標序列的特異性 | |
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PCR反應條件不合適 |
優化PCR反應條件，調整溫度和時間以提高擴增效率和信號強度 | |
| 高背景噪音或非特異信號 |
引物或探針的特異性問題 |
重新評估引物或探針的特異性，確保與目標序列的特異性 |
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汙染或汙染物幹擾 |
檢查實驗室環境和試劑純淨性，確保實驗無菌和無汙染 | |
| 異常的CT值或差異表達結果 |
實驗重複性問題 |
增加實驗重複次數，提高實驗的重複性 |
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數據處理問題 |
審查數據處理方法和參數，確保分析的準確性 | |
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樣品異質性 |
分析樣品中的異質性來源，如細胞亞群的存在或組織中不同細胞類型的混合 |
3、qRT-PCR在生物學和醫學研究中一些具體的應用領域和示例：
● 基因表達分析：qRT-PCR可以用於定量測量基因的表達水平，幫助研究人員了解基因在不同條件下的變化。例如，可以使用qRT-PCR分析藥物處理後特定基因的表達變化，如藥物治療後癌症相關基因的表達調控。
● 病原體檢測：qRT-PCR可用於檢測和定量病原體（如病毒、細菌等）的存在和數量。例如，在臨床實踐中，可以使用qRT-PCR檢測病毒感染，如COVID-19病毒的檢測。
● 突變分析：qRT-PCR可以用於檢測和定量DNA序列上的突變或多態性。例如，在遺傳疾病研究中，可以使用qRT-PCR分析突變基因的表達變化，進一步了解突變對基因功能和疾病發展的影響。
● miRNA研究：qRT-PCR可以用於定量測量microRNA（miRNA）的表達水平，揭示miRNA在基因調控和疾病發生中的作用。例如，可以使用qRT-PCR分析特定miRNA在腫瘤中的表達變化，研究其與腫瘤發展的關係。
● 表觀遺傳學研究：qRT-PCR可用於研究DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳標記的變化。例如，可以使用qRT-PCR分析特定組蛋白修飾酶的表達水平，探索其在表觀遺傳調控中的作用。
