雙熒光素酶檢測是轉錄調控研究中⼗分重要的實驗⼿段，主要應⽤於啟動⼦和轉錄因⼦，以及miRNA和其靶基因互作的驗證。

• 在雙熒光素酶檢測中，將螢⽕⾍熒光素酶作為實驗報告基因，海腎熒光素酶作為對照報告基因。實驗報告基因⽤於測試實驗條件下基因的表達，⽽對照報告基因作為內對照。
• 以熒光素為底物來檢測螢⽕⾍熒光素酶活性，熒光素酶可以催化熒光素，在熒光素氧化的過程中會發出⽣物熒光，然後通過化學發光儀測定。

原理簡介

● 轉錄因⼦與啟動⼦

將啟動子序列構建到螢火蟲熒光素酶基因前，同時過表達轉錄因子。當轉錄因子與啟動子上特異結合位點結合後激活熒光素酶基因轉錄，使螢火蟲熒光素酶得以表達，最終熒光強度上升；當結合位點被突變後，轉錄因子無法與啟動子結合，因此熒光值無明顯變化。

● miRNA與靶基因

將靶基因序列構建到螢火蟲熒光素酶基因3'區域，同時過表達microRNA。當microRNA與靶基 因上特異結合位點結合後，將幹擾熒光素酶mRNA的翻譯或導致其迅速降解，使熒光強度降低；當結合位點被突變後，microRNA無法與靶基因結合，因此熒光值無明顯變化。

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YY1-mediated reticulocalbin-2 upregulation promotes the hepatocellular carcinoma progression via activating MYC signaling.

期刊：Am J Cancer Res   IF：5.177

發表時間：2021

Schematic illustration of YY1 binding site on the wild type and mutant RCN2 promotor. Fluorescence activity in Huh7 cells with RCN2 wildtype and mutant promotor with YY1 pcDNA3.1.

凝膠遷移或電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一種檢測蛋白質和DNA 序列相互結合的技術，可用於定性和定量分析。目前已用於研究DNA 結合蛋白和特定的DNA 序列的相互作用，是轉錄因子研究的經典方法。

金開瑞提供EMSA 檢測技術服務，幫助您檢測DNA 結合蛋白、RNA 結合蛋白、特定的蛋白質。

原理簡介

目的蛋白與生物素標記的DNA探針結合，電泳時蛋白-DNA複合物比無蛋白結合的DNA探針在凝膠中泳動的速度慢，顯影出現相對滯後條帶。

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Nuclear factor kappa B/p65 plays a positive role in peroxisome proliferator-activated receptor δ expression in orange-spotted grouper Epinephelus coioides

期刊：Fish and Shellfish Immunology   IF：3.298

發表時間：2020

Binding reactions of Ecp65 and EcPPARδ promoter. Biotin-labelled EMSA probes are incubated with lysates of HEK293T cells including Ecp65 protein. WT, wild-type probe; MT, mutated probe. Positive control indicates EcPPARδ+Protein, negative control indicates EcPPARδ-WT.

ChIP染色體免疫共沉澱（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是用來研究蛋白質與DNA是否在體內存在相互作用，這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾。利用抗體抗原特異性結合，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉澱下來，能夠真實地反映結合在DNA序列上的調控蛋白。

原理簡介

細胞固定

染色質斷裂

染色質免疫沉澱

交聯反應的逆轉

DNA的純化及鑒定

PCR或高通量測序

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YAP inhibits autophagy and promotes progression of colorectal cancer via upregulating Bcl-2 expression

期刊：Cell Death Dis   IF：6.304

發表時間：2021

C ChIP-qPCR was performed in SW620 cells transfected with pcDNA3.1-HA-YAP to identify the enrichment of HA-YAP onto Bcl-2 promoter region. IgG served as an antibody control.

DNA pull down是用於分析蛋白質與DNA互作的一種分析技術。一般來說，該實驗首先需要針對待研究目的基因的調控區域設計並製備特異性探針（以脫硫生物素標記為主流）；同時，製備細胞核提取物；將探針和核提取物共同孵育，DNA結合蛋白就會和靶向序列特異性結合；然後，通過親和素磁珠純化蛋白質DNA複合物；最後針對獲得的蛋白，使用WB驗證或者質譜方式鑒定蛋白質類型。

應用：尋找已知的啟動子序列所結合的未知蛋白（轉錄因子）

原理簡介

體外合成生物素表達的DNA片段

提取細胞蛋白

生物素標記的DNA片段和細胞提取物

孵育

洗滌，洗脫

分析

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結果：實驗組和對照組之間存在差異條帶

酵母單雜交技術是在酵母雙雜基礎上發展而來的一種研究核酸-蛋白相互作用的工具，被廣泛用於研究真核細胞內基因的表達調控，如鑒別DNA結合位點發現潛在的結合蛋白基因、分析DNA結合結構域信息等。

原理簡介

核酵母單/雙雜交係統原理：酵母轉錄因子Gal4包含DNA結合結構域（Gal4-BD）和轉錄激活域（Gal4-AD），誘餌（prey）與Gal4-BD融合，獵物（bait）蛋白與Gal4-AD融合，當誘餌和獵物發生相互作用時，Gal4-BD和Gal4-AD在空間上充分接近，可呈現完整的GAL4轉錄因子活性，啟動激活報告基因AUR1-C、ADE2、HIS3和MEL1的轉錄。

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1: Pabai-Bait+PGADT7(自激活驗證)
2: Pabai-Bait+PGADT7-Prey(實驗組)
+: Pabai-P53+PGADT7-53(陽性對照)
- : Pabai-P53+PGADT7(陰性對照)

蛋白質與RNA 的相互作用是許多細胞功能的核心，如蛋白質合成、mRNA 組裝、病毒複製、細胞發育調控等。使用體外轉錄法標記生物素RNA 探針，然後與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質複合物。該複合物可與鏈黴親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。複合物洗脫後，通過WB 實驗檢測特定的RNA 結合蛋白是否與RNA 相互作用。若待檢測目的蛋白明確，選擇WB鑒定；若不明確，則可選擇質譜鑒定。

金開瑞現提供RNA pull down 檢測技術服務, 使用特異性二抗進行檢測，能有效避免抗體重鏈對結果的信號幹擾。並且金開瑞配套自己的質譜平台，能顯著提升檢測效果。

原理簡介

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Circular RNA circEsyt2 regulates vascular smooth muscle cell remodeling via splicing regulation

期刊：J Clin Invest   IF：11.864

發表時間：2021

CircEsyt2 inhibits the nuclear trafficking of PCBP1 by binding directly to PCBP1. (A) Western blotting of proteins pulled down by control and circEsyt2 probes in circEsyt2-OE HEK293T cells using the PCBP1 antibody. (B) Identification of circEsyt2-binding proteins. Left: silver staining of pulled-down proteins in circEsyt2-OE HEK293T cells. Right: mass spectrometry showing the main proteins pulled down by the circEsyt2 probe.

RIP 技術（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 結合蛋白免疫沉澱）主要是運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白複合物沉澱下來，然後經過分離純化就可以對結合在複合物上的RNA 進行q-PCR驗證或者測序分析。RIP 是研究細胞內RNA 與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄後調控網絡動態過程的有力工具，可以幫助我們發現miRNA 的調節靶點。

根據客戶需求，金開瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作驗證RIP技術服務。

原理簡介

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CircPVT1 promotes proliferation of lung squamous cell carcinoma by binding to miR-30d/e

期刊：J Exp Clin Cancer Res   IF：11.161

發表時間：2021

c RIP confirmed the relationship between circPVT1 and HuR in H520 cells. GAPDH mRNA was used as a non-HuR target control.

利用帶有標簽的已知蛋白作為誘餌蛋白（最常用的是GST標簽，即穀胱甘肽巰基轉移酶，glutathione S-transferase），誘餌蛋白特異性結合穀胱甘肽親和樹脂，當目的蛋白溶液過柱時，將誘餌蛋白及其相互作用的蛋白複合物捕獲。複合物洗脫後，通過蛋白凝膠電泳分析兩種蛋白間的相互作用，或者篩選相應的目的蛋白。

原理簡介

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Aberrant oligodendroglial LDL receptor orchestrates demyelination in chronic cerebral ischemia

期刊：J Clin Invest   IF：11.864

發表時間：2021

(C) GST pull-down assay revealing the interaction between LDLR and Shc (n = 3 in each group).

免疫共沉澱技術（co-Immunoprecipitation, co-IP）是一種研究兩種蛋白在體內是否存在相互作用的有效方法，通過抗體和已知蛋白結合，從而捕獲整個已知蛋白複合物，進而研究複合物中與已知蛋白存在相互作用的蛋白。

原理簡介

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Aberrant oligodendroglial LDL receptor orchestrates demyelination in chronic cerebral ischemia

期刊：J Clin Invest   IF：11.864

發表時間：2021

LDLR protects against demyelination by binding Shc and activating downstream MEK/ERK signaling. (A) Immunoassay of lysates of cerebral CC tissue after immunoprecipitation with LDLR, analyzed by immunoblotting (IB) with anti-LDLR and anti-Shc (n = 3 in each group).

酵母雙雜交及係統是一種鑒定和檢測蛋白質相互作用的研究方法，因其具有靈敏性高、功能強大、適用範圍廣等特點，現已被應用於多個研究領域。

金開瑞可提供酵母雜交文庫構建、核酵母雙雜交篩選、膜酵母雙雜交篩選、酵母單/雙雜交驗證服務。

原理簡介

膜酵母雙雜交係統原理：泛素ubiquitin包含N 端（Nub），C 端（Cub）結構域。首先，人為的將泛素 Nub的第3位異亮氨酸突變為甘氨酸（NubI 突變為 NubG）。這樣與 Cub 的親合力大大降低，避免了 Cub 和 Nub 自我結合或接近的可能性。在Cub結構域融合LexA-VP16 轉錄激活因子形成Cub-LexA-VP16。誘餌蛋白（prey）與NubG融合，獵物蛋白（bait）與Cub-LexA-VP16融合。當當誘餌和獵物發生相互作用時， NubG 和 Cub 的相互接近，結合，形成完整泛素ubiquitin，從而被 UBPs 酶識別，導致 LexA-VP16 的剪切，進入核內，從而激活報告基因AUR1-C、ADE2、HIS3和MEL1的轉錄。

案例分享

① 酵母雜交文庫構建

圖⽚來源於 Xu et al. BMC Biotechnology (2020) 20:4

② 酵母雙雜交篩選

陽性結果點鍾SD/-Leu/-Trp/-HIS3/-ADE2+X-α-gal平板

圖⽚來源於 Xu et al. BMC Biotechnology (2020) 20:4

陽性結果PCR鑒定

圖⽚來源於 Xu et al. BMC Biotechnology (2020) 20:4

③ 酵⺟雜交驗證（可⽤於⽂章發表）

1: PGBKT7-Bait+PGADT7(⾃激活驗證)
2: PGBKT7-Bait+PGADT7-Prey(實驗組)
+: PGBKT7-53+PGADT7-T(陽性對照)
- : PGBKT7-lam+PGADT7-T(陰性對照)